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| 用途

 

    體內(nèi) Rab5 激活水平的分析。

    檢測增強 Rab5 活性的化合物和蛋白質(zhì)。

    檢測抑制 Rab5 活性的化合物和蛋白質(zhì)。

    對細胞（組織）中的 Rab5 活性進行定位、定性、定量研究。

 

 

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| 產(chǎn)品說明

 

    小GTP酶Rab5是細胞內(nèi)部各類膜組分(membrane component)運輸?shù)年P鍵調(diào)節(jié)因子。Rab5在無活性的GDP結(jié)合形式和有活性的GTP結(jié)合形式之間循環(huán)。不同狀態(tài)的Rab5通過募集不同的下游效應物,調(diào)控囊泡的出芽、錨定和融合運輸。Rab5除了能夠調(diào)節(jié)早期胞內(nèi)體(early endosome)的融合,它還調(diào)節(jié)細胞自噬、線粒體的穩(wěn)態(tài)、染色質(zhì)的排列整合、細胞的遷移以及能量代謝等。此外,Rab5與腫瘤、阿爾茲海默癥及亨廷頓病也有著非常密切的關系目前還沒有直接測定Rab5 GTPases激活的方法。

 

   武漢紐萊生物科技有限公司推出的 Rab5 活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別 Rab5-GTP結(jié)合蛋白，而不識別 Rab5-GDP結(jié)合蛋白，進而簡單并且快速的進行 Rab5 的活性檢測。每個試劑盒可以進行 30 次免疫親和沉淀檢測。同時試劑盒中的 Rab5- GTP 單克隆抗體也可以通過免疫組化和免疫熒光對細胞和組織中的 Rab5 的活性進行監(jiān)測.

 

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| 檢測原理

 

    武漢紐萊生物科技有限公司的 Rab5 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構象的 Rab5-GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的（樣品需要進行 GTPγS 活化處理）活性Rab5-GTP的水平。簡言之，特異性識別 Rab5 活化構象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細胞裂解液中的 Rab5-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來，再利用特異性識別 Rab5 的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。

 

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| 試劑盒組份及儲存

       

名稱	貨號	規(guī)格	儲存溫度
Anti-active Rab5 mouse Monoclonal antibody	Cat.#NL23004	1x35ul	-20℃
Protein A/G Agarose	Cat.#NL30301	1x600ul	4℃
5xAssay/ lysis Buffer	Cat.#NL30303	1x30ml	4℃
Anti-Rab5 Rabbit polyclonal antiboy	Cat.#NL24004	1x50ul	-20℃
100xGTP-rS	Cat.#NL30302	1x50ul	-80℃
100XGDP	Cat.#NL30304	1x50ul	-80℃
HRP-Goat anti-Rabbit IgG	Cat.#NL29002	1x50ul	-20℃

 

注意:使用前應將100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復凍融。

 

試劑盒所需自備物品。

 

1.刺激和未刺激的細胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測試劑；

 

試劑盒注意事項

 

1.收到試劑盒后如不立即使用，請將試劑盒組分按照標簽說明存儲在相應的溫度，100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復凍融。 

2.Protein A/G Agarose使用前請稍微離心甩一下，因管壁上可能殘留，而且是用20%乙醇保存的，如果乙醇揮發(fā)，體積較少時很難將Agarose吹散，所以請補充20%乙醇等于Agarose的體積。

3.使用50% 的Protein A/G Agarose前先用槍將其吹勻，一個反應管使用20 ul的50% 的Protein A/G Agarose足夠。

4. 將50% 的Protein A/G Agarose加入反應管前先用1×Assay/Lysis Buffer洗滌3遍，以去除其中的乙醇，最后一遍用合適體積的1×Assay/Lysis Buffer懸浮Agarose，再分裝于 反應管，保證每管參與反應的50% 的Protein A/G Agarose有20 ul。

5. 為了減少50% 的Protein A/G Agarose的損失，可以先在反應管中加入適當體積的1×Assay/Lysis Buffer。

6. 反應管中試劑加入順序建議，先1×Assay/Lysis Buffer，然后是用Buffer稀釋的Protein A/G Agarose，細胞裂解液和活性抗體，總體積建議0.5ml-1ml

7. 活性抗體的加入量請適當做調(diào)整，如可以加入0.5ug、1ug或者2ug。

8. 孵育反應在4℃ 360度搖床進行。

9. 反應完畢，洗滌Agarose時候，盡量避免吸走Agarose。

 

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| 實驗操作步驟

 

A    試劑制備

 

1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 

B    樣品處理

 

        貼壁細胞

 

1.培養(yǎng)細胞密度達到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制劑進行處理. 

2.吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3.向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

4.將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5.用細胞刮棒把細胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

6.將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7.如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時，將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8.4°C 12000 g, 離心 10 min。

9.收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

        懸浮細胞

 

1.培養(yǎng)細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。

2.計數(shù)細胞后離心。

3.吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4.向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

5.反復吹打細胞進行裂解。

6.將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7.如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時，將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。    

8.4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用GTPγS/GDP處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）

 

注意：在細胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10%的 Rab5 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Rab5 被激活。 

1. 準備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物（如果是純的 Rab5 蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug）。

2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應 30 min 并不斷攪動。

5. 終止反應：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

 

D.激活 Rab5 的親和沉淀

 

1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細胞裂解物至微量離心管中。

2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的總體積調(diào)整到1ml 

3. 向管中加入 1ul 的活性 Rab5 單克隆抗體。(Cat.# NL23004)

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時，并輕輕的進行搖動。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。 

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實驗 

 

1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。 

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進行封閉，并需要恒定振蕩。 

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA Anti-Rab5 pAb (Cat.#NL24004),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的 Rab5 蛋 白的量）室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育.

8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。

10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

11. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。

 

   示例結(jié)果

 

下圖展示的是本公司的 Rab5 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。

 

                    

圖一： GTP和GDP處理的細胞裂解物（500ul ,1mg/ml)  與 ProteinA/G 和 Anti-Rab5-GTP Monoclonal Antibody  (1ul ,1mg/ml  Cat #  NL-23004)  進行孵育， 用 Anti Rab5 rabbit polyclonal antibody (稀釋比例，1:1000，Cat # NL24004)  進行蛋白印跡分析.

 

圖二：細胞裂解物（25ul ,1mg/ml), 用 Anti Rab5 rabbit polyclonal antibody (稀釋1:1000，Cat # NL24004)  進行蛋白印跡分析 .

 

圖三：細胞裂解物（25ul ,1mg/ml), 用 Anti- Actin rabbit polyclonal antibody (稀釋1:1000，Cat # NL28002)  進行蛋白印跡分析.

      

  

   

                    

                    與傳統(tǒng)的 GST- pull down 方法相比，該試劑盒具有以下明顯優(yōu)勢

 

 

1. 靈敏度高；誘導蛋白與目標蛋白中的結(jié)合對蛋白量的要求比較高。而抗體與蛋白的結(jié)合對樣本中蛋白的要求比較少。

2. 特異性強；因為誘餌蛋白是需要加上GST標簽的重組蛋白，所以是非生理狀態(tài)下的驗證，蛋白質(zhì)的結(jié)構和形式可能與天然狀態(tài)下存在一定差異，而抗體與目標蛋白的結(jié)合 ，活細胞狀態(tài)下蛋白質(zhì)之間的相互作用被保持，所以其反映的是細胞中真實的蛋白情況.

3. 應用更為廣泛；試劑盒中能夠特異性識別GTP結(jié)合狀態(tài)的三聚體G蛋白或者小G蛋白的單克隆抗體，適應各種種屬（Human，Mouse，Rat，Rice plants，Pig Cotton，bacteria，Escherichia coli等）應用范圍非常廣泛（ IP ,WB ,IHC IF ICF,ICC,IHF.FC,Elisa 等）隨著這些應用的普及，G 蛋白信號轉(zhuǎn)導的研究進展，必將進一步加快。