| 品牌： | NEWLF  |
| 價(jià)格： | 2200/2800 |
| 規(guī)格： | 48T/96T |
| 貨號(hào)： | NL27203 |
| 應(yīng)用： | 競(jìng)爭(zhēng)法 |
| 用途
該試劑盒用于體外定量檢測(cè)血清、血漿。組織勻漿，細(xì)胞裂解液，細(xì)胞培養(yǎng)上清，或其他相關(guān)生物液體中天然cAMP濃度。
| 基本性能
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性能 |
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靈敏度 |
21.2fmol/ml
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檢測(cè)范圍 |
0.08pmol/ml-250pmol/ml
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特異性 |
可檢測(cè)樣本中cAMP (環(huán)磷酸腺苷）的含量。且與其他類似物無明顯交叉反應(yīng)。
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重復(fù)性 |
板內(nèi)，板間變異系數(shù)均《10%
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| 產(chǎn)品說明
cAMP 是小分子的環(huán)狀核苷酸，以微量存在于動(dòng)植物細(xì)胞和微生物中，被稱其為細(xì)胞內(nèi) 的第二信使（激素為第一信使）。 cAMP 由腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生，被磷酸二酯酶降解，因此激活腺苷酸環(huán)化酶或者抑制磷酸 二酯酶，可以提高細(xì)胞內(nèi) cAMP 的含量。研究發(fā)現(xiàn)，cAMP 特異性磷酸二酯酶的抑制劑可用 于人類疾病的治療。如：增強(qiáng) β 腎上腺素能受體已被用于心率失調(diào)、高血壓、心肌梗死等心 臟疾病；cAMP 特異性磷酸二酯酶2/4的抑制劑正在進(jìn)行認(rèn)知增強(qiáng)方面的臨床測(cè)試。細(xì)胞內(nèi)cAMP的定量測(cè)定也可用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)腺苷酸環(huán)化酶激活或抑制作用的效價(jià)。cAMP 分子量只有329.21。所以cAMP的定量分析多采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法,且cAMP在機(jī)體內(nèi)的含量極低，為 pmol/L 級(jí)別，所以一種靈敏度高，特異性強(qiáng)。重復(fù)性高的 cAMP ELISA 檢測(cè)試劑盒是廣大科研工作者，最理想的選擇。
我們公司開發(fā)了一種基于鼠單克隆抗體的 cAMP ELISA 檢測(cè)試劑盒。該單克隆抗體對(duì)cAMP的 特異性比cAMP、ATP等類似的小分子高出108 倍以上。相較于其他的多克隆抗體cAMP試劑盒 ，我公司的 cAMP ELISA試劑盒能顯著的提高其靈敏性和特異性 ，且能有效避免來自動(dòng)物多克隆抗體的 批次間差異 因此可以提供長(zhǎng)久有效地可重復(fù)性定量檢測(cè)。
| 實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒利用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法來測(cè)定細(xì)胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的 cAMP 的水平。包被羊抗鼠多克隆抗體在酶標(biāo)板上，細(xì)胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的cAMP 與固定數(shù)量的標(biāo)記辣根過氧化物酶的 cAMP 競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合抗 cAMP單克隆抗體，采用已知濃度的 cAMP 標(biāo)準(zhǔn)品來做標(biāo)準(zhǔn)曲線。用酶標(biāo)儀 在 450 nm 波長(zhǎng)處測(cè) OD 值，cAMP 濃度與 OD450值之間呈反比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中 cAMP 的濃度。
| 研究背景
cAMP作為獨(dú)特的第二信使 ，可調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)各種外源和內(nèi)源信號(hào)分子的反應(yīng)。它主要通過激活蛋白激酶、控制特定的離子通道、磷酸二酯酶調(diào)節(jié)細(xì)胞環(huán)核苷酸濃度以及激Epac(通過cAMP直接激活 蛋白交換)(3-6)來調(diào)節(jié)生理過程。通過腺苷酸環(huán)化酶可以實(shí)現(xiàn)ATP轉(zhuǎn)化為cAMP。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的主 要腺苷酸環(huán)化酶家族均是橫跨膜的 ，具有9個(gè)亞型 ，且可通過G蛋白Gs或鈣離子/鈣調(diào)素(1)激活。另外 ，還有一種可溶性的腺苷酸環(huán)化酶 ，可以通過碳酸鹽或Ca2 +調(diào)節(jié)(7)。
| 試劑盒組份及保存
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中文名稱 |
規(guī)格 |
開封后保存條件 |
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ELISA 酶標(biāo)板 Goat anti-Mouse IgG Coated plate of 96 wells |
96T: 8孔 x12 條
48T: 8孔 x 6 條 |
2-8℃ 90天 |
| Assay Buffer A |
96T: 1x6ml 48T: 1X3ml
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2-8℃ 90天 |
| 0.1M HCl |
96T: 1X30ml 48T: 1X15ml |
2-8℃ 90天 |
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cAMP 標(biāo)準(zhǔn)品 |
96T: 1x0.1ml 48T: 1X0.05ml (5000pmol/ml) |
-80℃ 180天 |
| 10XAssay Buffer |
96T: 1x15ml 48T: 1x7.5ml |
2-8℃ 90天 |
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濃縮cAMP 鼠單抗（1000x) Anti- cAMP monoclonal antibody (1000 X) |
96T: 1x6ul 48T: 1x3ul |
-80℃ 180天 |
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濃縮 cAMP-HRP (1000x) HRP conjugated with cAMP (1000x) |
96T: 1x6ul
48T: 1x3ul |
-80℃ 180天 |
| 顯示液A substrate A |
96T:1x12ml 48T:1x6ml |
2-8℃ (避光) 90天 |
| 顯示液B substrate B |
96T:1x12ml
48T:1x6ml |
2-8℃ (避光）90天 |
| 終止液 stop solution |
96T: 1x6ml
48T: 1x3ml |
2-8℃ 90天 |
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封板覆膜 |
3個(gè) |
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| 產(chǎn)品說明書 Manual |
1份 |
注：收到試劑盒后 ，若不立即使用 ，請(qǐng)按照標(biāo)簽說明存儲(chǔ)在相應(yīng)的溫度。CAMP-HRP 濃縮液，及A,B顯色液應(yīng)避光保存。
| 試劑盒所需自備物品
| 樣品處理
組織樣本：需預(yù)先冰凍于液氮中。在不銹鋼研缽中用液氮將組子樣本研磨成精細(xì)粉末。待液氮揮發(fā)完后 ，稱量冰凍組織樣本并加入10倍體積的0.1M
HCl混勻。室溫以大于600g離心力離心 ，取上 層清夜用0.1M HCl稀釋至適當(dāng)濃度。
細(xì)胞樣本：首先移除培養(yǎng)基 ，然后加入0.1M HCl處理細(xì)胞。孵育10分鐘 并觀察細(xì)胞是否被裂解；如果裂解充分 ，接著孵育10分鐘并觀察，以大于
600g離心力于室溫離心 ，收集上清直接用于實(shí)驗(yàn)。 臨用前在0.1M HCl中加入0.1%至1%濃度的Triton-x 100可增強(qiáng)細(xì)胞和組織裂解。
尿液，血漿和培養(yǎng)液 ： 每1ml樣品中加入1.2ml (0.1Mol) 鹽酸混勻后，室溫離心5min（600 g）留上清，用于本試劑盒檢測(cè)。因?yàn)?，血漿、血清、全血和組織勻漿通常含有磷酸二酯酶（phosphodiesterases）和大量免疫球蛋白（Ig），它們會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)。用0.1 M HCl處理樣品，可以滅活磷酸二酯酶和降低免疫球蛋白的濃度，能更加精準(zhǔn)的檢測(cè)樣本中cAMP的濃度。
備注：我公司的試劑盒，適用于檢測(cè)經(jīng)過鹽酸處理的樣品，因內(nèi)源性磷酸二脂酶具有水解細(xì)胞內(nèi)第二信使 cAMP濃度。而用0.1M鹽酸處理樣本可以終止內(nèi)源性磷酸二脂酶的活性能更加精準(zhǔn)的檢測(cè)樣本中cAMP的 水平。
| 試劑盒注意事項(xiàng)
1. 收到試劑盒后若不立即使用 ，請(qǐng)將試劑按照標(biāo)簽說明存儲(chǔ)在相應(yīng)的溫度 ， -80℃低溫保存的抗體和 酶儲(chǔ)液為避免反復(fù)凍融請(qǐng)按每次需要量進(jìn)行分裝凍存；若立即使用，請(qǐng)將整個(gè)試劑盒置于4℃保存。
2. 使用前請(qǐng)將試劑盒各個(gè)試劑平衡到室溫 (至少30min) 。
3. 用試劑預(yù)先潤(rùn)洗槍頭在使用；取各種樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和試劑必需更換槍頭。
4. 移取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品到微孔底部。
5. 從微孔的邊緣加入試劑 ，以避免污染。
6. 本試劑盒使用可拆分的微孔酶標(biāo)條 ，使用者可根據(jù)樣品量多少進(jìn)行拆分。未使用的酶標(biāo)條保持干 燥 ，密封于試劑盒提供的鋁封袋中 ，于4℃保存。微孔酶標(biāo)條需安裝在相應(yīng)的框架上使用。
7. 在加入顯色底物前 ，確保微孔內(nèi)沒有殘留的洗滌液。微量殘留的洗滌液可能導(dǎo)致分析結(jié)果的變化。
| 檢測(cè)前準(zhǔn)備工作
1. 提前30分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫(18-25℃)。如果試劑盒需分 多次使用，請(qǐng)僅取出本次實(shí)驗(yàn)所需的酶標(biāo)板條和試劑，剩余板條和試劑需 按照指定條件保存。
2. 1x Assay Buffer：將15 mL 10× Assay Buffer加到135 mL去離子水中 ，稀釋成工作液。稀釋液可在室溫保存至試劑盒有效期限 ，或者3個(gè)月。
3. CAMP標(biāo)準(zhǔn)品工作液：將5000 pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液平衡至室溫。然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋。。倍比稀釋方法：從#1至#7標(biāo)記七只潔凈試管。移取475μ L 0.1M HCl到#1號(hào)試管 ，400μ L到#2至#7號(hào)試管。加入25μ L 5000 pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品到#1管中 混勻配置成250pmol/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。從#1管中取出100μ L溶液至#2管中，混勻。以此類推 ，重復(fù)上步操作 ，梯度稀釋至#6 管。經(jīng)以上操作 ，#1至#6管中cAMP標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為250, 50，10, 2. ,0.4 和 0.08 pmol/mL (詳見下圖) 。提示：最后一管 #7直接作為BO孔(0 pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品)。，不需要再?gòu)?6管中吸取液體。 稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品需在30分鐘內(nèi)使用。
4.cAMP-HRP Conjugate工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量 （以50ul/孔計(jì)算) ，實(shí)際配置時(shí)應(yīng)多配置100-200ul.使用15分鐘，用配好的1x Assay Buffer,將cAMP-HRP Conjugate （1000×) 稀釋成1x工作濃度。當(dāng)日使用。
5.Anti-cAMP Monoclonal Antibody工作液： 實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量 (以50ul/孔計(jì)算) ，實(shí)際配置時(shí)應(yīng)多配置100-200ul.使用前15分鐘 ，用配好的1x Assay Buffer,將 Anti-cAMP Monoclonal Antibody ( 1000×) 稀釋成1x工作濃度當(dāng)日使用。
| 實(shí)驗(yàn)步驟
1.分別設(shè)定 標(biāo)準(zhǔn)孔，BO孔 (0 pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品)，Blank孔（空白孔） 樣品孔，建議全部設(shè)立復(fù)孔（參照下圖2） 待測(cè)樣品孔，可視實(shí)際需要， 酌情考慮。
2.移取50μ L Assay Buffer A至各個(gè)微孔中 ，除Blank(空白)孔外。
3. 移取100μ L 0.1M HCl至B0孔(0 pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品)。
4. 移取100μ L 倍比稀釋的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品至相應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)孔。
5. 移取100μ L樣品至相應(yīng)的各樣品孔。
6. 移取50μ L 偶聯(lián)酶至各孔中，除了Blank(空白)孔。
7. 移取50μ L 抗體工作液至各孔中 ，除了Blank(空白)孔。
8. 給酶標(biāo)板覆膜，室溫孵育1小時(shí)。提示：加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)間宜控制10分鐘。
9 在吸水紙上拍干微孔內(nèi)溶液 ，加1x Assay Buffer 250μ L每孔洗3次 ，每次需拍干。
10.最后一次洗滌 ，清空各微孔 ，在干凈的無塵吸水紙上輕巧酶標(biāo)板數(shù)次,以確保沒有洗滌液殘留。
11.每孔 200μ L顯色底物溶液 ,于室溫避光孵育10分鐘。(顯色底物A和B需在臨用前15分鐘內(nèi)等體積混合,并避光放置）提示：根據(jù)實(shí)際顯色情況酌情縮短或延長(zhǎng)，但不可超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)(前4個(gè)顯色孔出現(xiàn)明顯藍(lán)色梯度)，即可終止。提前15分鐘打開酶標(biāo)儀預(yù)熱。
12. 每孔加入50μ L終止液。終止反應(yīng)。
13. 立即用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。
| 操作流程圖
圖一
圖二
| 結(jié)果判斷
1. ELISA的樣本通常要設(shè)置1~2個(gè)復(fù)孔進(jìn)行檢測(cè)，分別求出標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)驗(yàn)組樣本的吸光度的平均值。單個(gè)樣本的檢測(cè)值不應(yīng)超出平均值的20%
2. 用軟件ELISA Calc 的logistic 曲線擬合2（四參數(shù)）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（X軸上為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，Y軸為對(duì)應(yīng)的OD值）
3. 若樣品OD值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線下限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
| 典型數(shù)據(jù)
由于實(shí)驗(yàn)操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和穩(wěn)定條件等），標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值會(huì)有所差 異。
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
| ELISA 結(jié)果計(jì)算（點(diǎn)擊下載）
| cAMP ELISA 試劑盒性能分析（點(diǎn)擊下載）
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