| 用途
本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中 5’-核苷酸酶(NT5E)含量。
| 實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人 5’-核苷酸酶(NT5E)水平。用純化的人 5’-核苷酸酶(NT5E)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入 5’-核苷酸酶(NT5E)，再與 HRP 標(biāo)記的 5’-核苷酸酶(NT5E)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 5’-核苷酸酶(NT5E)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人 5’-核苷酸酶(NT5E)濃度。
| 基本性能
性能 | |
靈敏度 | 1.25pg/mL |
檢測范圍 |
5.0pg/mL - 120pg/mL |
特異性 | 可檢測樣本中的人 5’-核苷酸酶(NT5E)濃度。且與其他類似物無明顯交叉反應(yīng)。 |
重復(fù)性 | 板內(nèi)，板間變異系數(shù)均《10% |
| 試劑盒組份及儲存
中文名稱 | 規(guī)格 | 開封后保存條件 |
ELISA 酶標(biāo)板 | 96T : 8 孔×12 條 48T : 8 孔×6 條 | 2-8℃ 90天 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 96T : 0.5ml x1 (240pg/mL) 48T : 0.25mlx1 | 2-8℃ 90天 |
HRP標(biāo)記抗體 | 96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 | 2-8℃ 90天 |
樣品稀釋液 | 96T : 1.5mlx1 48T : 1mlx1 | 2-8℃ 180天 |
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 | 2-8℃ 180天 |
顯色劑A | 96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 | 2-8℃(避光） 180天 |
顯色劑B | 96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 | 2-8℃(避光） 180天 |
終止液 | 96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 | 2-8℃ 180天 180天 |
30倍濃縮洗滌液 | 96T : 20mlx1 48T : 10mlx1 | 2-8℃ 180天 180天 |
說明書 | 1份 | |
質(zhì)檢報告 | 1份 | |
密封袋 | 1個 |
說明；未拆封的試劑盒可以在2-8℃ 保存六個月.
| 試劑盒所需自備物品。
1.酶標(biāo)儀(450nm波長濾光片)
2.高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3.37℃恒溫箱
4. 雙蒸水或去離子水
5. 吸水紙
6. 加樣槽
| 樣品收集方法（具體處理方法請咨詢）
1. 血清：用無菌管收集，室溫血液自然凝固10-20分鐘，2-8℃條件離心20分鐘左右 （2000-3000轉(zhuǎn)/分）仔細收集上清，保存過程中 如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、肝素鈉或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
4. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將剪碎的組織與 對應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適 當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步 裂解組織細胞，可以對勻漿液進行反復(fù)凍融或超聲破碎。最后將勻漿液于2-8℃，5000×g 離心5-10分鐘取 上清檢測。
5. 細胞提取液：貼壁 細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞。懸浮 細胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每106個細胞中加入150-200 μL PBS重懸(推薦在PBS 中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可減少PBS的體積)并通過反復(fù)凍融或超聲使細胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測。
6. 細胞培養(yǎng)上清或其他生物體液；收集液體后于2-8℃，1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細胞碎片，取上清檢測。
| 試劑盒注意事項
1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未 用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2. 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品 稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（n×5)
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物請避光保存。
7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9. 本試劑不同批號組分不得混用。
| 樣本收集注意事項
1. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
2. 標(biāo)本采集后盡快進行實驗，若不能馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 我們羅列的是通用的樣本處理方法，無法涵蓋各種樣本，對于一些特殊樣本，建議實驗人員多參考已發(fā)表的文獻，自行設(shè)計合理的樣本 處理方法。
| 檢測前準(zhǔn)備工作
1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。
2. 用雙蒸水將30×濃縮洗滌液稀釋成1×工作液。未用完的放回4 ℃。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
120pg/mL |
5號標(biāo)準(zhǔn)品 |
150μl 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
60pg/mL |
4號標(biāo)準(zhǔn)品 |
150μl 的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
30pg/mL |
3號標(biāo)準(zhǔn)品 |
150μl 的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
15pg/mL |
2號標(biāo)準(zhǔn)品 |
150μl 的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
7.5pg/mL |
1號標(biāo)準(zhǔn)品 |
150μl 的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 操作步驟
1. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、 待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加 樣 50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液. 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底 ）部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
2. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
3. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復(fù) 5 次，拍干。
4. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。
5. 溫育：操作同 2
6. 洗滌：操作同 3
7. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.
8. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
9. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應(yīng)在加終 止液后15分鐘以內(nèi)進行。
| 操作一覽表
| 結(jié)果判斷
1. 每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD 值應(yīng)減去空白孔的OD值。
2. 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，利用計算機軟件采用直線回歸的擬合方法創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。
3. 若樣本的OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
| 示例曲線
由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和穩(wěn)定條件等），標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值會有所差異。詳情請看質(zhì)檢報告.
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