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| 用途

  本試劑盒用于體外定量檢測(cè)大鼠 血清、血漿、或其他生物液中大鼠還原型輔酶Ⅱ(NADPH)濃度。     

| 實(shí)驗(yàn)原理

  本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠還原型輔酶Ⅱ(NADPH)水平。用純化的大鼠還原型輔酶Ⅱ(NADPH)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，再與 HRP 標(biāo)記的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠還原型輔酶Ⅱ(NADPH)濃度。 

|  基本性能

| 試劑盒組份及儲(chǔ)存

說明；未拆封的試劑盒可以在2-8℃ 保存六個(gè)月.

| 試劑盒所需自備物品。

 1.酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng)濾光片) 

 2.高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 

 3.37℃恒溫箱 

 4. 雙蒸水或去離子水 

 5. 吸水紙 

 6. 加樣槽

| 樣品收集方法（具體處理方法請(qǐng)咨詢）

1.  血清：用無菌管收集，室溫血液自然凝固10-20分鐘，2-8℃條件離心20分鐘左右  （2000-3000轉(zhuǎn)/分）仔細(xì)收集上清，保存過程中  如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2.  血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、肝素鈉或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成應(yīng)該再次離心。

3.  尿液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

4. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將剪碎的組織與 對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適 當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步 裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行反復(fù)凍融或超聲破碎。最后將勻漿液于2-8℃，5000×g 離心5-10分鐘取 上清檢測(cè)。

5.  細(xì)胞提取液：貼壁 細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞。懸浮 細(xì)胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS洗滌3次。每106個(gè)細(xì)胞中加入150-200 μL PBS重懸(推薦在PBS 中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可減少PBS的體積)并通過反復(fù)凍融或超聲使細(xì)胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測(cè)。

6. 細(xì)胞培養(yǎng)上清或其他生物體液；收集液體后于2-8℃，1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片，取上清檢測(cè)。

| 試劑盒注意事項(xiàng)

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未 用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。 

2. 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。 

3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。 

4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請(qǐng)先用樣品 稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（n×5) 

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 

6. 底物請(qǐng)避光保存。 

7. 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn). 

8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。 

9. 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

|  樣本收集注意事項(xiàng)

1. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2. 標(biāo)本采集后盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 我們羅列的是通用的樣本處理方法，無法涵蓋各種樣本，對(duì)于一些特殊樣本，建議實(shí)驗(yàn)人員多參考已發(fā)表的文獻(xiàn)，自行設(shè)計(jì)合理的樣本 處理方法。

|  檢測(cè)前準(zhǔn)備工作

1. 請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。

2. 用雙蒸水將30×濃縮洗滌液稀釋成1×工作液。未用完的放回4 ℃。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

|  操作步驟

1. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、  待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加 樣 50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液. 40μl，然后再加待測(cè)樣品 10μl（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底 ）部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。 

2. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。  

3. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此  重復(fù) 5 次，拍干。 

4. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。 

5. 溫育：操作同 2 

6. 洗滌：操作同 3 

7. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘. 

8. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。 

9. 測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。測(cè)定應(yīng)在加終 止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。 

|  操作一覽表  

|  結(jié)果判斷

 1. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD 值應(yīng)減去空白孔的OD值。

 2. 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)軟件采用直線回歸的擬合方法創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計(jì)算樣品的濃度值。

 3. 若樣本的OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

 |  示例曲線

 由于實(shí)驗(yàn)操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和穩(wěn)定條件等），標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值會(huì)有所差異。詳情請(qǐng)看質(zhì)檢報(bào)告.